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原代細胞的培養與建系

細胞的來源多樣,培養方法也各不相同,凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。原代細胞經分散接種之手段稱為傳代。凡能經傳代方式進行再次培養的細胞稱為傳代細胞。若能穩定生長傳至10~20代以上的細胞可確立為細胞系。若有條件能開展單細胞克隆、純化,經大量擴增后所形成的生物學特性穩定的克隆化細胞群,稱之為細胞株或克隆細胞。此過程稱為細胞的純化或細胞克隆。這些基本技術是從事細胞培養工作的基礎,只有熟悉和掌握了基本技術,才可能更快捷地學習和掌握其他方法,本章重點敘述常用的基本技術。   

 

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第一節 原代細胞的取材   

人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件,是進行細胞培養的第一步,若取材不當,將會直接影響細胞的體外培養,現將取材的基本要求和注意事項敘述如下:   

一、取材的基本要求   

(1)取材要注意新鮮和保鮮 新鮮組織易于培養成功,取材時應盡量在4~6h內能制作成細胞,盡快入箱培養,若不能即時培養,應將組織浸泡于培養液內,于4℃存放。若組織塊較大,應在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結締組織后,切碎于培養液內4℃存放,但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應加入含10%二甲基亞砜的培養基,按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。   

(2)取材應嚴格無菌 所取標本材料應在無菌條件下進行,為了確保無菌,對所取材料若疑有污染的可能,應將所取組織在含高濃度抗菌素(400單位/mL)甚至加入適量的兩性霉素B或10%達克寧液的培養液內于4℃下存放2小時以上,再用PBS洗2~3次,以確保所取材料無菌。要用無菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養液(內含400單位/mL抗菌素)的小瓶等便于攜帶的物品來取材,所取材料應避免接觸有毒有害的化學物質,如碘、汞等。   

(3)取材和原代細胞制作時,要用鋒利的器械,如手術刀或剃須刀片切碎組織,盡可能減少對細胞的機械損傷。   

(4)要仔細去除所取材料上的血液(血塊)、脂肪、壞死組織及結締組織,切碎組織時應避免組織干燥,可在含少量培養液的器皿中進行。   

(5)取材應注意組織類型、分化程度、年齡等,一般來講,胚胎組織較成熟個體組織容易培養,分化低的較分化高的組織容易生長,腫瘤組織較正常組織容易培養。取材時應盡量選用易培養的組織進行培養。   

(6)原代細胞取材時要同時留好組織學標本和電鏡標本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細的記錄,以備以后查詢。   

二、各類組織的取材技術   

(一) 皮膚和粘膜的取材   

皮膚和粘膜是上皮細胞培養的重要組織來源,主要取自于手術過程中的皮片,方法似外科取斷層皮片手術操作,但面積一般2~4cm2即可,這樣局部不留疤痕,若對燒傷皮膚進行上皮細胞膜片移植,可從大腿或臀部取較大皮片,可取2~4cm2皮片,但取材時不要用碘酒消毒;若培養上皮細胞,取材時不要切取太厚,盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織;若欲培養成纖維細胞,則反之。皮膚粘膜與外界相通部位,因表面細菌、霉菌很多,取材時應嚴格消毒,必要時要用高濃度抗菌素和適量兩性霉素B漂洗、浸泡。   

(二)內臟和實體瘤的取材   

內臟除消化道外基本是無菌的,但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位,實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域,要避開破潰、壞死液化部分,以防污染,盡量去除混雜的結締組織,否則培養后,由于成纖維細胞的生長給以后的培養工作增加困難。對于一些特殊細胞培養的取材,詳見后面有關章節。   

(三)血液細胞的取材   

血液及淋巴組織中的血細胞、淋巴細胞的取材,一般多抽取靜脈外周血,或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞,取材時應注意抗凝,通常采用肝素抗凝,常用肝素濃度為8~10u/mL血,抽血的針筒也要用肝素濕潤,若從血站取來的獻血員的血液,因血站不用肝素抗凝劑,常用含枸椽酸鹽抗凝,對此類血標本千萬不能用含鈣、鎂離子的洗液來處理細胞,因此時的鈣、鎂離子可加速血液中凝血酶促進血液凝固而影響收獲血細胞及淋巴細胞。此外要嚴格無菌,盡量新鮮使用。   

(四)骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材   

取上述標本時,除嚴格無菌,注意抗凝外,還要盡快分離培養,一般無需其他處理,離心后,用無鈣、鎂PBS洗兩次,再用培養液洗一次后即可培養,不宜低溫存放。具體操作詳見后面有關章節。   

(五)動物組織取材   

1、鼠胚組織取材   

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物,然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中,5分鐘后(注意時間不能太長,以避免酒精從口或其他通道進入體內,影響組織活力),取出動物,在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢,切開皮膚,用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚,用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾,把動物反包,暴露軀干,然后再固定,更換無菌解剖器材,采用無菌操作法解剖取出胚胎。   

2、幼鼠胚腎(或肺)取材   

幼鼠采用上述方法處死消毒后,腹部朝上固定在木板上,先切開游離毛皮并拉開至兩側:然后采用無菌法打開胸腔取肺,或背部朝上固定在木板上,先將背部毛皮切開游離并拉向兩側,然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。   

(六)人胚體組織取材   

在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒,無菌法取人胚肺(腎),方法與鼠類相同。   

(七)雞(鴨)鳥類胚胎組織取材   

取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋,用照蛋燈在暗處燈檢,若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋,說明胚體發育良好,并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上,先用溫水清洗蛋殼,再用75%酒精棉球擦干,經碘酒、75%酒精消毒后,在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室,沿氣室邊緣去除蛋殼,再用眼科鑷撕去殼膜,暴露出雞胚,再用彎頭鑷輕挑起胚頭,取出胚胎,放入無菌平皿中,解剖取材。   

第二節 原代細胞的分離和制作   

人或動物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密,不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖,即使采用1mm3的組織塊,也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長,若需獲取大量細胞,必須將現有的組織塊充分散開,使細胞解離出來,常采用的方法如下:   

一、懸浮細胞的分離方法   

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘,若懸液量大,可適當延長離心時間,但速度不能太高,延時也不能太長,以避免擠壓或機械損傷細胞,離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次,用培養基洗一次后,調整適當細胞濃度后再分瓶培養,若選用懸液中某些細胞,常采用離心后的細胞分層液,因為,經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據需要收獲目的細胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細胞分離培養的章節。   

二、實體組織材料的分離方法    

對于實體組織材料,由于細胞間結合緊密,為了使組織中的細胞充分分散,形成細胞懸液,可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。   

(一)機械分散法   

所取材料若纖維成分很少,如腦組織,部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針),使細胞通過針頭壓出,或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡便、快速,但對組織機械損傷大,而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。   

(二)消化分離法   

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀),應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動,使團塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時再采用機械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細胞團塊得以較充分的分散,制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液,接種培養后,細胞容易貼壁生長。   

1、酶消化分離法   
        酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶,其分離方法如下:   

(1) 胰蛋白酶分散技術    

胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。   

①細胞類型 胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效,但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。   

②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經過測定而有效,但配制時必須新鮮,需保存在低溫冰箱中,消化時的pH和溫度都要適宜,否則會影響活力,細胞的分散直接與酶的活力有關,最終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時活力最強。   

該酶為粉劑,保藏時要防潮,室內溫度不宜過高,保存時間不能太長,若粉劑結團塊,說明該部分受潮或失效。   

③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時,濃度可適當提高,消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性,而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進細胞的增殖,若培養液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。   

④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時活性最強,但由于對細胞有損害而不能被采用,常使用的溫度為37℃,通常在37℃進行消化比室溫作用快。   

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強分散快,細胞也容易被消化下來,消化分離細胞時PH只能選用7.6~8.0之間,否則對細胞有損傷。   

⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時,可以發生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應采用無鈣鎂離子的PBS配制。   

⑦消化時間 如果細胞消化時間過長,可以損害細胞的呼吸酶,從而影響細胞的代謝,一般消化時間為20分鐘為宜,冷消化時使用低濃度消化液,于4℃過夜也可。   

分離方法如下:   

①過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次,剪成碎塊大小為4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織,再加入0.25%的胰蛋白酶,搖勻后放4℃過夜,次日再用Hanks液洗滌,棄去上清,共洗2~3次,然后,加入少量營養液吹打分散,細胞計數,按適當的濃度分瓶培養。   

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種:   

熱消化多次提取——將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘,然后經洗滌后用營養液分散制成細胞懸液,按合適的濃度分瓶培養,然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作,再消化提取細胞。   

冷消化多次提取——方法同上,只是消化溫度為4℃。   

先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經洗滌后用營養液分散,制成懸液,剩余未消化的小組織塊經洗滌后用胰酶于4℃下過夜,次日再提取細胞,分散成懸液,分瓶培養。   

(2) 膠原酶(Collagenase)消化法    

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配制,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.1~0.3mg/mL。此酶消化作用緩和,無需機械振蕩,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本。   

經過膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細胞對酶有耐受性,可能有一些上皮細胞團塊尚未被完全消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長,因此不必要再進一步消化處理。   
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間(小時)有差異(見表4-2),以及兩者價格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時還可加透明質酸酶(對細胞表面糖基有作用),采用兩者的聯合消化作用,對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。   

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別   

項 目                               胰蛋白酶                          膠原酶   
消化特性                         適用于消化軟組織              適用于消化纖維多的組織   
用 量                             0.01%~0.5%                  0.1~0.3mg/mL(200u/mL)   
消化時間                            0.5~2小時(小塊)               1~12小時   
pH                                    8~9                            6.5~7.0   
作用強度                               強烈                                緩和   
細胞影響                          時間過長有影響                     無大影響   
血清、鈣、鎂離子                     有影響                           無影響   

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5~1cm3) 

酶 種 類                           較 硬 組 織                       軟 組 織   
                                  4℃ 室 溫 37℃                   4℃ 室 溫 37℃   
胰蛋白酶(0.25%)                  24~48 1~6 1~2                 12~24 1~2 0.5~1   
膠原酶(200u/mL)                   24   6   6.5                     12   3   0.25   
兩者聯合(對沖)                  12~46 12~24 4~12                12~24 6~12 1~2   

除上述兩種最常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年來,還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。   

2、非酶消化法(EDTA消化法)   

EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物,利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離,缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀,有團塊,常不單獨使用,但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1),不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散,可降低胰酶的用量和毒性作用。   

消化分離法的操作步驟:   

(1)剪切 把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。   

(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。   

(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當時間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。   

(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。   

(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應,采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培養基。   

(6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法,使細胞充分散開后用紗網或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養,若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細胞懸液進行分瓶培養。   

注意事項如下:   

(1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。   

(2)胰蛋白濃度不宜過高,作用時間不能太長,以避免毒性作用。   

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產生,而且動作要輕,以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。    

三、原代細胞的培養方法   

原代細胞的培養也叫初代培養 是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養,是建立細胞系的第一步,是一項基本技術。原代細胞因剛從組織中分離開,生物學特性未發生很大變化,仍保留原來的遺傳特性,也最接近和反映體內生長特性,適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。   

原代細胞往往有多種細胞組成,比較混雜,即使從形態上為同一類型(上皮樣或成纖維樣),但細胞間仍有很大差異。如果供體不同,即使組織類型、部位相同,個體差異也照樣存在,原代細胞生物特性尚不穩定,如需做較為嚴格的對比性實驗研究,還需進行短期傳代培養。   

1、組織塊培養法   

組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法,也是早期采用培養細胞的方法,故原先被稱為組織培養。其方法:為將剪成的小組織團塊接種于培養瓶(或皿)中,瓶壁可預先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細胞能沿瓶壁向外生長,方法簡便,利于培養,部分種類的組織細胞在小塊貼壁24小時后細胞就從組織塊四周游出,然后逐漸延伸,長成肉眼可以觀察到的生長暈,5~7天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發生漂浮,此漂浮小塊可隨換液而棄去,由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片,可在顯微鏡下觀察形態和用于實驗研究。  

其培養方法如下:   

(1)按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm3大小的小塊,并加入少許培養基使組織濕潤。   

(2)將小塊均勻涂布于瓶壁,每小塊間距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培養瓶(底面積為17.5cm2)可接種20~30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉培養瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內。   

(3)培養2~4小時,待小塊貼附后,將培養瓶緩慢翻轉平放,靜置培養,動作要輕,嚴禁搖動和來回振蕩,以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養失敗,若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養時培養基不宜多,以保持組織塊濕潤即可,培養24小時后再補液,培養初期移動和觀察時要輕拿輕放,開始幾天盡量不去搬動,以利貼壁和生長,培養3~5天時可換液,一方面補充營養,一方面去除代謝產物和漂浮小塊所產生的毒性作用。   
原代細胞培養-2   

2.消化培養法   

該方法是采用前述的消化分散法,將妨礙細胞生長的細胞間質(包括基質、纖維等)去除,使細胞分散形成細胞懸液,然后分瓶培養。   

某些特殊類型細胞,如內皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟,將在有關章節中敘述。   

3.懸浮細胞培養法   

對于懸浮生長的細胞,如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化,可采用低速離心分離,直接培養,或經淋巴細胞分層液分離后接種培養。   

4.器官培養   

器官培養是指從供體取得器官或組織塊后,不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養,其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯系、并能存活,器官培養的目的和技術均與單層細胞培養不同,但可利用器官培養對器官組織的生長變化進行體外觀察。并觀察不同培養條件研究對器官組織的影響。器官培養可保持器官組織的相對完整性,可用于重點觀察細胞間的聯系、排列情況和相互影響,以及局部環境的生物調節作用。體外器官培養為臨床上的器官移植創造了便利的條件。器官培養的條件與細胞培養不同,要有特殊的要求。   

1. 器官培養的特殊的要求   

(1)需要特殊的培養條件 因器官離體培養,其營養和氧氣僅靠自然滲透來供給,因此,培養時為了確保中心不發生缺乏氧和營養而造成壞死,其厚度或直徑不宜超過1mm。   

(2)器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法:   

a. 將器官組織塊置于培養基氣液面以利于氣體交換。   

b. 提高培養基中的氧分壓,一般需加注純氧,提高氧分壓時仍需保持5% CO2,以維持pH。   

2. 器官培養的方法   

(1)將不銹鋼網做成的支架,放置于培養皿中,高度為1/2皿高,使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   

(2)將培養基加入平皿中,使培養液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起。   

(3)將要培養的器官組織平放在濾膜上,一般厚度不要超過200μm,水平面積不超過10mm2,如為肝、腎不能大于1mm2。   

(4)將培養物置于CO2培養箱內,并加注氧氣,調整氧分壓達90%,培養時注意使液面與膜保持在一致的水平上。   

(5)上述器官培養1~3周(每隔2~3天換液一次)后可用于實驗和檢測。     

第三節 原代和傳代細胞的培養和維持   

一、原代細胞的培養與維持   

(一)原代細胞培養   

1、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)   

凡經消化液處理實體組織來源的細胞要通過充分漂洗,以盡量除去消化液的毒性,細胞接種時濃度要稍大一些,至少為5×108細胞/L,培養基可用Eagle(MEM)或DNEM培養,小牛血清濃度為10%~80%,有條件的應在37℃ 5% CO2的培養箱中培養,在起始的2天中盡量減少振蕩,以防止剛貼壁的細胞發生脫落,漂浮。若原代貼壁細胞不是用于長期培養,只是用于分離繁殖或測定病毒之用,其細胞濃度可以加大,盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結果(如空斑)更加明顯、準確,待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網狀,此時的pH若有明顯變化,應將原代細胞換液,即倒去舊液,換入新鮮的培養基,以便除去衰老、死亡的細胞和陳舊的培養基,使貼壁細胞能獲得充足的營養。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養1周時,可有少量的肌樣纖維間質細胞或基質細胞開始貼壁生長,為了利于該貼壁細胞充分貼壁和生長,此時換液應將細胞懸液經低速離心后,按半量換液方式棄去舊液加入新液,然后再將細胞懸液放入原瓶中繼續培養,經反復幾次換液后,貼壁肌樣細胞逐漸形成網狀,此時換液可將原懸浮細胞和培養基移入另一新瓶,然后分別補加新鮮培養基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續培養,原瓶的貼壁細胞逐漸長成單層,而新瓶中又會出現二次貼壁細胞,經幾次換液也會逐漸長成單層,在此類細胞培養時,培養基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清(濃度要在20%以上),以利細胞貼壁生長。   

2、懸浮細胞的培養   

凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結、骨髓的淋巴細胞、造血干細胞以及白血病細胞,在原代培養時要盡量去除紅細胞。若作用于試驗的短期培養,可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進行培養,細胞濃度可在5~8×109/L范圍內,然后進行分瓶試驗。若要將淋巴細胞及白血病細胞進行長期培養,淋巴細胞中要加入生長因子,白血病細胞中要加入少量的原患者血清,以利細胞生長,待細胞開始增殖甚至結成小團塊,培養基中pH變酸,說明細胞生長繁殖良好,一般每隔3天需半量換液一次(換液時盡量使細胞不丟失),待細胞增殖加快,濃度明顯增加,pH發生明顯變化時,此時可考慮傳代。但千萬不能急于傳代,一定要待細胞密度較高時才能進行,以防傳代失敗。  

 

(二)原代細胞的維持   

1、貼壁細胞(包括半貼壁細胞的換液)   

貼壁細胞長成網狀或基本單層時,由于營養缺乏,代謝產物增多,pH變酸,不適宜細胞生長,此時細胞還未長成單層,未達到飽和密度,仍需繼續培養,因此,需采取換液方式來更新營養成分以滿足細胞繼續生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單,即棄去舊液,加入與原培養液相同的等量完全培養基。若希望細胞能在較長時間內能維持存活,但不需增殖,此時要換成含2%小牛血清的維持液。   

2、懸浮細胞   

凡經培養后只在細胞培養基中懸浮生長而不貼壁的細胞,需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態和生長現象,淋巴細胞的短期培養無需換液,但加入生長因子或有絲分裂源(PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等)后,細胞不僅會發生轉化而且會發生分裂繁殖,此時培養基中的營養成分并不能維持細胞的營養需求,加之代謝產物增多,pH變酸,細胞不適宜生長,需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養時,都需換液培養,待達到飽和密度時才能傳代。換液時,只能采用半量換液的方式,千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。 

半量換液的方法如下:   

將原培養瓶豎起,在30分鐘內,若細胞沉于瓶底,可用吸管輕輕吸去一半上清棄去,再加入等量的新鮮完全培養基。若細胞不能沉于瓶底,可吸出細胞懸液,采用低速離心(1000r/min 10min)棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養基,混勻后再轉入原瓶繼續培養。   

二、原代細胞培養的首次傳代   

原代培養后由于懸浮細胞增殖,數量增加甚至達飽和密度,貼壁細胞的相互匯合,使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋,細胞難以繼續生長繁殖,需要進行分瓶培養,這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。每進行一次分離再培養稱之為傳一代,傳至5~10代以內的細胞通常稱為次代培養細胞,傳至10~20代以上的細胞,通常確定為傳代細胞(或稱傳代細胞系)。然而,傳代細胞系的建立,關鍵是初代培養的首次傳代。 

應注意如下幾點:   

(1)細胞生長密度不高時,或未能達到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。   

(2)原代培養的貼壁細胞多為混雜細胞,形態各異,往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存,采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間,因成纖維細胞易于脫壁,上皮細胞不易脫壁,因此,可根據需要選用適當的消化時間及時中止消化。在早先傳代時,其消化時間比一般已建系的細胞相對長一些。   
(3)吹打已消化的細胞要輕巧,既不能聽到有明顯的吹打聲,又不能有大量泡沫在懸液中形成,以盡可能減少對細胞的機械損傷。   

(4)首次傳代時細胞接種數量要多一些,以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊,也一并傳入到培養瓶,盡量減少細胞損失。   

(5)首次傳代培養時的pH不能高,寧可偏低一些。此外,小牛血清濃度可適當加大至15%~20%左右。   

三、傳代細胞的傳代培養   

原代細胞經傳代后所形成的傳代細胞,可根據不同細胞采取不同的方法進行細胞傳代。貼壁生長的細胞用消化法傳代,部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進行傳代,或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進行傳代。后兩種傳代方法比較簡單,唯有貼壁細胞的消化傳代法比較復雜一些。 

現將具體方法介紹如下:   

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基(以25mL培養瓶為例)。   

(2)每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS,漂洗一次后倒掉。   

(3)每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液),輕輕搖動培養瓶,經消化液鋪滿所有細胞表面,待細胞層略有松動,肉眼可觀察到“薄膜”現象時,倒掉消化液,再繼續作用2~3分鐘,輕輕搖動,細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來,在顯微鏡下可發現細胞回縮變圓,細胞間隙增大,此時應立即終止消化。   

(4)加入完全培養基5mL,用吸管反復吹打瓶壁上的細胞,吹打時要按順序進行,以確保所有瓶壁均吹打到,吹打時動作要輕柔,不要用力過大,盡可能不要出現泡沫,以避免細胞的機械損傷。   

(5)用計數板計數,計算細胞的濃度,并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。   

四、傳代細胞的建系和維持   

細胞系的維持是培養工作的重要內容,是通過換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來實現的,但對每一個細胞系來說都有其自身的特點,要做好建系的維持須注意以下幾點:   

1.細胞檔案   

細胞檔案要記錄好,如組織來源、生物學特性(由形態、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等)、培養基的要求、傳代換液時間、擴增時間(分裂指數),細胞的特殊遺傳標志(標記染色體)等,這些記錄對于保證細胞的正常生長,保持細胞的一致和經長期培養細胞特性的變異比較,都有十分重要的意義。   

2.換液傳代   

(1)細胞系的傳代、換液方法與前相同,但一般都有自身的規律性,因而在繼續傳代時,要注意保持其穩定的規律性,這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規律而導致細胞生長特性的改變,給以后的實驗帶來影響。   

(2)多種細胞系維持傳代,要嚴格操作程序,對所用的試劑各系不能交叉,甚至每個細胞系均需單獨實驗室,傳代時各系均分開單獨操作,每傳5代后,細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄,培養瓶上要有明顯標記,標記細胞系名稱和傳代的代數及傳代時間。若細胞生長較快,可減去換液程序,每次均可傳代。每個傳代細胞系,最好能分成2~3條線,分別傳代,同時也可在適溫或4℃短期存放一瓶,以防止污染丟失。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失,而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異,此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。   

3.細胞系(或株)的鑒定和管理   

當一個細胞系(或株)建立后,專家鑒定可有可無,按國際慣例,只要認真研究,記錄完整,資料和結果確切,就可在有關雜志上或刊物上報道細胞的各次實驗指標。   

下面為美國標準細胞庫或細胞銀行(ATCC)入庫細胞的基本要求:   

(1)培養簡歷 組織來源日期、物種、組織來源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態,細胞已傳代數等。   

(2)凍存液 培養基和保護劑名稱。   

(3)細胞活力 凍融前后細胞接種存活率和生長特性(生長繁殖曲線,分裂指數等)。   

(4)培養液 培養基種類和名稱、血清來源及濃度。   

(5)細胞形態 類型,如上皮或成纖維細胞等。   

(6)核型 二倍體或多倍體,標記染色體有或無。   

(7)無污染情況 包括細胞、真菌、支原體、原蟲和病毒等。   

(8)物種檢測 檢測同功酶,主要為G6PD和LDH,以證明細胞有無交叉污染。   

(9)免疫檢測 一兩種血清學檢測。   

(10)細胞建立者 建立者姓名、檢測者姓名。    

第四節 細胞的純化和克隆   

體外培養的細胞源于人或動物體內或胚胎組織,其體內的細胞都是混雜生長,每一種組織都有血管和間葉組織,因此,來源于上述組織的培養材料的原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長,即有上皮樣細胞,又有纖維樣細胞,纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等,混雜的細胞會直接影響實驗結果,而利用體外培養細胞進行實驗研究時,為了保證實驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可重復性,要求采用單一種類細胞來進行實驗,這樣才能對某一細胞的功能、形態等變化進行一系列研究,因而培養細胞的純化就成為實驗研究的重要一步,甚至需要從混雜的細胞群中分離出單個細胞來進行培養和開展實驗研究。   

一、細胞的純化   

細胞的純化一般分為兩種,即自然純化和人工純化。可根據不同細胞種類、來源、實驗要求和目的選擇采用。   

(一)自然純化   

自然純化即利用某一種類細胞的增殖優勢,在長期傳代過程中靠自然淘汰法,不斷排擠其他生長慢的細胞,靠自然增殖的潛力,最后留下生長優勢旺的細胞,達到細胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及目的來選擇細胞,此法花費時間長,留下來的往往是成纖維細胞。僅有那些惡性變的腫瘤細胞或突變的細胞可以通過此方法而保留下來,不斷純化而建立細胞系。   

(二)人工純化   

人工純化,即利用人為手段造成某一細胞生長有利的環境條件,抑制其他細胞的生長從而達到純化細胞的目的。   

1、細胞因子依賴純化法   

人和動物組織中某些細胞需要有特殊的細胞因子存在的微環境才能長期存活和生長繁殖,如IL-2是T細胞生長所必需的細胞因子,BCGF是B細胞的生長因子,體外培養中淋巴細胞若加入IL-2就可使T細胞生長繁殖,形成IL-2依賴的T細胞系,如CTLL-2細胞株,而其他細胞則自然被淘汰,采用此法還建立了IL-6依賴的細胞系,如B9、CTD7細胞株。   

2、酶消化法   

酶消化法是比較常用的純化方法,不僅對貼壁細胞可行,能利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,使兩者分開,達到純化的目的,對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。   

(1)上皮細胞與成纖維細胞的分離純化   

兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細胞先脫壁,而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁,特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。 

方法如下:   

①采用常規消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內兩次,每次加1mL(25mL培養瓶)來回輕搖1-2次,使胰蛋白酶流過所有細胞表面,然后倒掉。   

②蓋好瓶塞(或蓋),將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發現纖維樣細胞變圓,部分脫落,立即加入2mL有血清的培養液終止消化。   

③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長的區域(可事先在鏡下用記號筆在培養瓶上劃出記號)。吹打時不要用力,也不要吹打上皮細胞生長區域。吹打結束后,再用少量培養液漂洗一遍,然后加入適量培養液于瓶內繼續培養,也可重復上述操作再進行一次,隔幾日后或下次傳代時,再進行上述操作,經過幾次處理,就可將成纖維細胞去除或將兩者分開。   

(2)骨髓基質肌樣細胞的純化   

在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時,常有許多肌樣細胞和骨髓基質細胞貼壁生長,但也有許多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上,種類混雜,鑒于粘附細胞貼壁不牢固,也可用酶消化法使粘附細胞脫壁分離,以達到骨髓基質細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開和純化的目的。 

其方法如下:   

①待基質或肌樣細胞基本形成單層時,倒去舊液,加入無鈣、鎂PBS漂洗,并用力搖動后倒掉,反復洗2~3次后,一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化,另一方面又可使大部分粘附細胞被洗掉,但仍留有不少粘附細胞。   

②將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內,每瓶1mL(25mL培養瓶),輕輕搖動讓胰蛋白酶流過細胞表面,作用1~2分鐘后再輕輕搖動1~2次后倒去。   

③蓋好瓶蓋,在普通顯微鏡下觀察,發現基質或肌樣細胞由于貼壁較牢固未脫壁,而原先粘附的細胞已浮起,此時再加2mL PBS洗一次倒掉,盡量除去粘附細胞。   

④加入含血清的培養基終止消化,再繼續用力搖動后倒掉,加入培養基繼續培養。隔幾日或下次傳代前,再進行上述操作,經過幾次處理和傳代培養后就可將粘附細胞去除,將兩者分開,達到使骨髓基質細胞或肌樣細胞純化的目的。   

3、機械刮除法   

原代培養時,如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長,每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長在瓶壁上。可采用機械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域。

 

其方法如下:   

(1)將要純化細胞的培養瓶,在凈化室內放在倒置顯微鏡監視下進行。   

(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細胞區域推劃,使細胞懸浮在培養液中,注意不要傷及所需細胞。   

(3)推劃后用培養液沖洗振搖兩次倒掉,即可將培養基加入原瓶繼續培養。   

(4)數日后如發現不需要的細胞又長出,可再進行上述操作,這樣反復多次可以純化細胞。操作過程中要嚴格無菌操作,防止污染。   

4、反復貼壁法   

成纖維細胞與上皮細胞相比,其貼壁過程快,大部分細胞能在短時間內(大約10~30min)完成附著過程(但不一定完全伸展),而上皮細胞(大部分)在短時間內不能附著或附著不穩定,稍加振蕩即浮起,利用此差別可以純化細胞。 

其方法如下:   

(1)將細胞懸液接種在一個培養瓶內(最好培養液內不含血清,此時上皮細胞貼壁更慢)靜置20分鐘。   

(2)在倒置顯微鏡下觀察,見部分細胞貼壁,稍加搖動也不浮起時,將細胞懸液倒入另一培養瓶中,繼續靜置培養20min,然后再重復上述操作后,即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開,在第1瓶和第2瓶以成纖維細胞為主,往后幾瓶即以上皮細胞為主,下次傳代時再按上述方法處理,就可使兩者達到完全分開的目的。   

5、電烙篩選法   

在貼壁細胞轉化時,往往在培養瓶的細胞層中會出現分散的轉化灶,轉化灶區域細胞密集、排列規則,有明顯生長趨勢,與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限,此時即可用機械刮除法去除未轉化細胞,也可用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。 

其方法如下:   

(1)倒去舊液,并用記號筆劃出轉化灶的區域。   

(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉化灶周邊的細胞全部燙死,只保留轉化灶細胞。在單細胞克隆篩選時,也可用此法將單個細胞周圍的細胞殺死,然后在適應性培養基中(50%是舊液)繼續培養,即可達到純化的目的。   

二、細胞的克隆化   

        細胞克隆技術又稱單個細胞分離培養技術,即從細胞群體中分離出一個細胞,并使其在體外培養體系中能繁殖成新的細胞群體,這種由單個細胞所形成的細胞群(或集落)稱為一個克隆,這種純化后的細胞群體稱為細胞株。它們當中每個細胞的遺傳特征和生物學特性極為相似和一致,有利于對不同群體細胞的形態和功能進行比較和研究。若該細胞株只是一般傳代、無一系列實驗鑒定指標,則為一般細胞株。若有一系列實驗指標報道的,則稱為限定性細胞株,如由幼地鼠腎細胞系(BHK21)第13孔的單個細胞形成的細胞株稱BHK-21C-13(代表克隆13),其形態規則,特性穩定,便于研究。   

        單一細胞體外培養能否生長繁殖最后形成克隆,這與各細胞克隆形成率有關,如果細胞克隆形成率偏低(小于10%)應采用一些措施,如改用胎牛血清,適應性培養基添加刺激因子(如胰島素、地塞米松、細胞生長因子等),調節CO2濃度以控制pH。若貼壁效果差可選用適當的適應性底物(如膠原層或血漿纖維蛋白層),以及制備底層的飼養細胞。用X線或60Co照射處理的細胞層,如雞胚細胞、骨髓基質細胞,該細胞照光后只有代謝功能,無增殖和傳代能力,或選用短壽的細胞,常選用鼠腹水巨噬細胞作飼養細胞,用于單克隆抗體雜交瘤細胞的克隆化。 

具體克隆方法如下:   

1.毛細管法:   

將一定量的細胞懸液(如105/mL或更低)稀釋至1個細胞/mL,取10mL稀釋的細胞懸液,用直徑為0.5mm,長為8mm的毛細玻璃管若干(30~50只),在負壓作用下,使懸液吸入各毛細管中,在倒鏡下檢查出每管只進入一個細胞的毛細管,然后放入適應性培養基或有飼養層細胞的培養瓶(或培養板)內,在CO2培養箱中培養,由一個細胞在毛細管繁殖后,并向管外擴展,并形成單個克隆的細胞群體。   

2.有限稀釋法   

有限稀釋法采用梯變倍數稀釋的原則,將稀釋的細胞懸液接種于微孔培養板中(也可在板上的96孔中直接稀釋)培養一定時間后,孔中可出現單個細胞克隆,本法不需特殊設備,操作簡單快速,適合大批量克隆化培養。現已廣泛用于異質性細胞系的克隆化培養、誘導和分離耐藥性或高轉移性、或突變細胞株以及單克隆抗體雜交瘤細胞株的克隆篩選中。 

具體方法如下:   

(1)取對數生長期的細胞制成懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成),經臺盼藍染色計數,測定活細胞數及濃度(細胞存活率及單個細胞百分率應高于90%以上)。   

(2)將細胞懸液在試管中稀釋,用培養基將細胞稀釋至50個細胞/mL、10個細胞/mL、5個細胞/mL,將3種稀釋度的細胞分別接種于96孔板中,每孔為0.1mL,于37℃ 5%CO2下培養。   

(3)次日在倒置顯微鏡下觀察培養板各孔中的細胞數,挑選只含一個細胞的孔,做好標記并補加0.1mL培養液繼續培養。   

(4)培養期間,視pH值的變化決定是否換液或補加培養液,一周左右,孔中有明顯克隆出現,待長至孔底面的1/3~1/2時,可用消化法將96孔中的單一克隆的細胞分別移至24孔板中進行擴大培養。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內將單個細胞形成克隆并進行分離培養的方法如下:   

(1)將對數生長期細胞制備單個細胞懸液(懸浮細胞用吸管吹打分散,貼壁細胞先用0.25%胰蛋白酶消化后,再用培養基吹打分散)計數并用培養基調整細胞濃度,使5mL培養液內含有50~200個細胞(細胞存活率及單個細胞百分率應大于90%以上)。   

(2)將上述細胞懸液迅速移入60mm平皿中,在37℃ 5% CO2下培養1周或更長。若有明顯的克隆形成時方可進行克隆分離,方法有兩種:   

①套環法:在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況, 標記單個克隆周邊,吸干培養基,用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環,套住標記的克隆,在套環內滴加少量0.25%胰蛋白酶,待細胞脫離時,用注射器針頭輕輕吹打分散后,轉入小平皿或24孔板或6孔板中擴大培養。   

②玻片法:在接種細胞懸液前,預先在60mm平皿中放入無菌小玻片,加入細胞懸液,培養一定時間后,在倒置顯微鏡下標記上含一個克隆的玻片,然后用無菌鑷子取出標記玻片轉入24孔培養板中繼續培養。   

4.軟瓊脂克隆分離法   

本法僅適用于懸浮培養的類淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞,而正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆。   

(1)將對數生長期的細胞制成單個細胞懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個細胞)作活細胞計數。調整細胞濃度至1×106細胞/L,然后根據實驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個細胞/L為佳。   

(2)制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中,使瓊脂完全溶化,取出一份5%瓊脂,移入小燒杯中,待冷至50℃,迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養液(即成為0.5%瓊脂),混勻后立即注入24孔培養板中,每孔含0.5% 瓊脂0.8mL,置室溫使瓊脂凝固備用(此層也可以省略)。   

(3)制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液9.4mL,移入小燒杯中,加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻,即配成0.3%瓊脂培養基,立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養板中,每孔0.8ml,置室溫使瓊脂凝固。   

(4)于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長,若需培養更長時間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培養液,待有明顯集落形成為止。   

(5)集落(克隆)計數:在倒置顯微鏡下觀察并計數直徑大于75μm或含有50個細胞以上的克隆。  

5.單細胞顯微操作法   

借助顯微操縱器,在顯微鏡監控下將單個細胞逐個吸出,移入含有飼養層細胞的培養板中進行培養。本法準確性好,如無顯微操縱器可自制毛細吸管替代。

 

方法如下:   

(1)飼養層細胞的制備 單個細胞在極低密度下生長非常緩慢,甚至難以分裂,為了促進克隆細胞的生長繁殖,常采用飼養層細胞,飼養細胞種類和制備方法依實驗要求而定,現以3T3小鼠纖維細胞為例:   

①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的3T3細胞,調整細胞濃度為108細胞/L,在96孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于37℃ 5% CO2中培養至單層。   

②將已形成單層的3T3細胞板,用60Co γ線以4000~6000拉得輻射或在培養液中加入絲裂霉素(終濃度為10-6mol/L)作用16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失,但仍可短期存活,有代謝功能,不僅可維持pH而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長的因子。飼養細胞處理后需更換新鮮培養液。   

(2)制備單個細胞懸液 方法同上。   

(3)分離單個細胞 其方法多樣,可根據實驗條件決定:   

①毛細管吸入法 同上述毛細管法,在顯微鏡下將只有一個細胞的毛細管取出。   

②微滴法 將經稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液,用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴,在顯微鏡下挑選出單個細胞的液滴,再用毛細管取出單個細胞懸滴。   

③液體石蠟法 將經稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液,用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部,在倒置顯微鏡下挑選只有一個細胞液滴,仔細用毛細吸管取出有一個細胞的液滴。   

④玻璃小球附著法 將稀釋至103個細胞/L的細胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中,混勻后,在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個細胞的玻珠,仔細用鑷子取出。   

(4)將采用上述方法分離出的單個細胞,放入預先制備飼養層細胞的96孔培養板中,于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長。   

(5)待細胞克隆明顯,并使孔底覆蓋1/3~1/2時,即可將細胞轉種于24孔板進行擴大培養(貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種)。 

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